Обращенно-фазовые ВЭЖХ-колонки для работы в 100% воде

Коллапс смачивания

В инструкциях на классические обращено-фазовые колонки С18 / С8 написано, что рекомендуемая доля воды в подвижной фазе составляет не более 95 %.

Если такую колонку уравновесить 100 % водой, то через некоторое число инжекций она может потерять способность удерживать вещества. Так происходит из-за того, что неполярная поверхность пор сорбента размером < 100 А перестает смачиваться водой (происходит т.н. «phase dewetting»):

Потеря смачивания мелких пор ОФ-сорбента при переходе на 100 % воду

Зачем вообще использовать в качестве подвижной фазы в ОФ-режиме 100 % воду? На самом деле, это требуется не так уж и редко. Например, при анализе сильно-полярных соединений в ОФ-режиме:

При добавлении даже минимальных количеств ацетонитрила/метанола в подвижную фазу, удерживание целевых веществ может снижаться вплоть до нуля. При удерживании веществ k´≤ 0,2 осуществить разделение двух пиков методом ОФ-хроматографии невозможно.

Был разработан специальных класс обращено-фазовых сорбентов позволяющих работать на 100 % водных подвижных фазах (в названии таких сорбентов есть слово «Aqua» или «Aq»):

1. ОФ-сорбенты на основе модифицированного силикагеля (С8–С30): предотвращение "коллапса смачивания" достигается за счет полярных вставок или полярного эндкепинга
2. Несиликагелевые сорбенты (Shodex Asahipak, YMC Triart и т.д.): "коллапса смачивания" не происходит за счет полярной основы

Виды Aqua-колонок

1. Фазы с меньшей долей углерода, по сравнению с "классическими С18”, и с полярным эндкепингом

Колонки на основе классического силикагеля, но с полярными добавками или с полярным эндкепингом. Точный химизм таких колонок обычно «засекречен», поэтому вряд ли легко будет подобрать «аналогичную» фазу другого производителя. Из-за «секретных» полярных добавок, такие фазы могут проявлять непрогнозируемую адсорбционную селективность, что не всегда полезно. К таким колонкам относятся, например:

Обычно, такие фазы разрабатывались для решения конкретных аналитических задач: «рабочее» название колонки Zorbax SB-Aq – «Metaxalone-phase».

2. Высокоуглеродистые стационарные фазы

Эта группа стационарных фаз, по сравнению с «классическими С18» обладает другой метиленовой, shape-селективностью и удерживающей способностью, что следует учитывать при воспроизведении методик на 100 % водных подвижных фазах. Такие фазы имеют самую высокую метиленовую и самую низкую shape-селективность среди ОФ-колонок. К ним относятся относятся, например:

3. Фазы с полярными вставками

Третья группа aqua-колонок – это фазы вообще не на основе ODS в привычном понимании. Стационарная фаза модифицирована полярными вставками: амидной или эфирной группой. Эти сорбенты, помимо возможности работы на чистой воде, обладают дополнительной CT-селективностью (charge-transfer):

4. Обращенно-фазовые колонки изготовленные не на основе силикагеля

Некоторые фазы изготовлены на полимерной основе, а для некоторых колонок доподлинно неизвестно: силикагель это или нет. Чаще всего, производитель заявляет, что это «Unique material»:

5. Колонки с размером пор 200 Å и более

Из-за особенностей строения, крупнопористые адсорбенты великолепно смачиваются водой. К достоинствам таких фаз можно отнести возможность работы с крупными молекулами, например, белками. Основным недостатком таких колонок является значительно более низкая эффективность и емкость по сравнению с «классическими» фазами с порами около 100 Å. В названии таких фаз могут быть фразы типа «Bio», «300 (размер пор)» или «Wide pore»:

Особенности воспроизведения методик с aqua‑колонками

Градиентные разделения, разработанные на aqua-колонках, как правило, хорошо воспроизводятся как на aqua-колонках одного класса, так и на «обычных» фазах С18. Для решения проблем с разрешением, в зависимости от положения критической пары на хроматограмме, можно отрегулировать состав подвижной фазы на любом из участков градиента.

При переносе изократические разделения с одной aqua-колонки на другую могут возникать проблемы из-за разной и обычно непрогнозируемой селективности.

При воспроизведении изократических методик на 100 % воде следует выбрать колонку хотя бы из «близкой» группы. Например, почти все колонки C16-amide будут давать похожую CT-селективность (charge-transfer), а метиленовая селективность будет зависеть, в основном, от доли углерода.

Из всех aqua-сорбентов, наиболее «ортогональны» для С18 именно фазы, содержащие амидные группы.

Регенерация и хранение

Aqua-колонки после длительной работы в воде необходимо регенерировать – промывать от неполярных загрязнений органическими растворителями, например, ацетонитрилом.

И самое главное: несмотря на то, что это aqua-колонки, хранить их в воде нельзя! Лучший растворитель для хранения обращенно-фазовых силикагелевых колонок – смесь ацетонитрила с водой в соотношении 8:2

Выводы