Школа по ВЭЖХ 2017

Специфичность в ВЭЖХ
- Специфичность определения. Специфичность хроматографического разделения и специфичность де-тектирования.
- Классификация выполняемых анализов по характеру поставленной цели: рутинные (targeted) и исследо-вательские (untargeted) разделения. Различие в подходах к решению аналитических задач обоих типов.
- Виды детектирования, применяемые в ВЭЖХ. Оптические, испарительные, электрохимические, масс-селективные детекторы. Преимущества и недостатки различных видов детектирования.
- Принцип выбора детектора с оптимальной для данной аналитической задачи специфичностью.
- Способы ВЭЖХ детектирования, недооцененные в фармацевтическом анализе.

Качественный и количественный анализ
- Основы качественного анализа. Проверка отрицательной гипотезы. Идентификация соединений. Спосо-бы повышения надежности идентификации соединений: хроматографические и спектральные. Ограниче-ния процедуры “peak purity test”, реализуемой на диодно-матричных детекторах.
- Проведение разметки хроматограммы. Различные способы проведения разметки; параметра разметки.
- Функции автоматической разметки. Настройка автоматической разметки.
- Основы количественного анализа. Основы статистики. Методы внутреннего и внешнего стандартов. От-клик детектора. Одноточечная и многоточечная градуировки, целесообразность их применения в различ-ных случаях. Одноточечная градуировка. Доверительный интервал. Типы многоточечной градуировки. Модели аппроксимации. Линейная аппроксимация и ее параметры. Типичные затруднительные ситуации и ошибки, допускаемые при применении многоточечной градуировки с аппроксимацией линейной регрес-сией.

Разработка хроматографического разделения. Основные режимы хроматографии
- Основные параметры разделения. Факторы, определяющие разрешение пары пиков.
- Оптимальное удерживание. Оптимальная селективность. Оптимальная эффективность.
- Общий алгоритм разработки ВЭЖХ методики.
- Основные адсорбционные (RP, NP, HILIC, IC, CT, LEC) и эксклюзионные (SEC, IEX) режимы жидкостной хроматографии.
- Модель удерживания для обращенно-фазового (RP) режима. Регулирование удерживания и селективно-сти. Преимущества и недостатки обращенно-фазовой хроматографии.
- Модель удерживания для нормально-фазового (NP) и гидрофильного (HILIC) режимов. Регулирование удерживания и селективности.
- Модель удерживания для ионного (IC) режима. Регулирование удерживания и селективности.
- Буферные растворы, применяемые в ВЭЖХ. Выбор буфера. Выбор концентрации и ионной силы.

Смешанные хроматографические режимы. Работа с ион-парными системами
- Смешанные ВЭЖХ режимы, широко применяемые на практике. Понимание характерной (уникальной) селективности ВЭЖХ неподвижной фазы как следствия смешения двух или более ВЭЖХ режимов.
- Преимущества и недостатки смешанных режимов. Целесообразность их применения.
- Смешанные режимы в обращенно-фазовой хроматографии (RP/HILIC, RP+IC, RP/CT, RP + SEC).
- Смешанные режимы в гидрофильной хроматографии (HILIC + IC).
- Смешанные режимы в нормально-фазовой хроматографии (NP/CT).
- Регулирование доли каждого из вкладов в смешанном режиме.
- Применение динамического модифицирования для перехода к смешанным режимам.
- Ион-парные системы, их преимущества и недостатки. В каких случаях применяют добавки ион-парных реагентов. Насколько применение ион-парного режима вообще оправдано.
- Как работают добавки ион-парных реагентов; какие ион-парные реагенты наиболее популярны.
- Как бороться с плохой воспроизводимостью ион-парных разделений.
- Совместимы ли ион-парные разделения и градиентное элюирование.
- Как можно удешевить ион-парное разделение.
- Как уйти от применения ион-парной добавки.
- Техника работы при использовании ион-парных реагентов.

Оценка удерживания и селективности разделения соединений
- Оценка удерживания соединения в основных и смешанных режимах по его структурной химической формуле.
- Сложные случаи при анализа многокомпонентных лекарственных средств. Проведение разделения при наличии в смеси веществ разной природы (ионные/неионные, полярные/неполярные и др.) Примеры из фармацевтической отрасли.

Неподвижные фазы в ВЭЖХ
- Современное состояние рынка неподвижных фаз (НФ): обзор. НФ различного типа для обращенно-фазовой (RP), гидрофильной (HILIC) и ионной (IC) хроматографии.
- Есть ли смысл в разнообразии неподвижных фаз. Зачем для одного вида хроматографии выпускают не-подвижные фазы с различными типами прививок. Зачем нужны колонки различных типоразмеров, то есть разной длины и с разным размером частиц. Существуют ли “самые лучшие” колонки
- Что подразумевается под “качеством” колонки. Какую колонку можно считать качественной. Какие при-знаки свидетельствуют о нарушениях в технологии упаковки колонок. В каких случаях можно попытаться заменить плохо упакованную колонку у производителя. Как обезопасить себя от покупки плохо изготов-ленной колонки   
- Какие основные типы обращенных фаз доступны на рынке. Какие существуют типы прививок для обра-щенно-фазовых силикагелей. Чем определяется величина удерживания на данной обращенной фазе? В чем состоит преимущество алкиламидных (С16-Amide и подобных ей) фаз. В чем состоит преимущество арил-привитых (PFP, PYE и подобных им) фаз. В чем состоит преимущество алкил-привитых фаз с ионными группами (C18/SAX, C18/SCX, C18/WCX).
- Что такое энд-кеппинг. Какими преимуществами обладает полярный энд-кеппинг. Как узнать тип энд-кеппинга обращенной фазы. Что обозначают различные аббревиатуры в названиях обращенно-фазовых колонок. Какие бывают химии полимерных обращенных фаз. Почему фазы на основе силикагеля приме-няют чаще полимерных фаз. В чем состоят преимущества и недостатки применения поверхносто-пористых обращенных фаз.
- Названия хроматографических колонок. Что обозначают различные аббревиатуры и сокращения в на-звании колонок.
- Тестирование обращенно-фазовых (RP) ВЭЖХ колонок.
- Как выбрать «колонку, аналогичную данной».

Градиентное элюирование в ВЭЖХ
- Градиентное элюирование в обращенно-фазовой хроматографии. Выбор профиля градиента.
- Техника проведения градиентного элюирования.
- Область применения градиентного элюирования. Ограничения градиентного элюирования.

Оптимизация ВЭЖХ-разделений
- Оптимизация ВЭЖХ разделения. Критерии оптимизации.
- Теория скоростей. Гидродинамика ВЭЖХ разделения. Алгоритм выбора оптимальной скорости потока.
- Алгоритм выбора оптимальной длины колонки и размера частиц адсорбента.
- Факторы, определяющие «дополнительное» уширение хроматографических пиков. Мертвые объемы. Перегрузка объемом пробы и количеством вещества.
- Факторы, влияющие на уширение хроматографических пиков. Правильная сборка жидкостной системы. Типы капилляров и фитингов, их правильное применение.

Разделение оптических изомеров. Работа с хиральными колонками.
- Оптические изомеры. Энатиомеры. Диастереомеры.
- Хиральные сорбенты. Классификация. Аббревиатуры и сокращения в названии коммерческих хираль-ных колонок.
- Разработка разделений. Механизмы разделения. Как выбрать хиральную колонку для разделения опти-чески активных изомеров исходя из их структуры?
- Предосторожности при работе с хиральными колонами.
- Регулирование селективности разделения изомеров на хиральных неподвижных фазах.
- Практические примеры хиральных разделений в фармацевтической отрасли.

Робастность и трансфер ВЭЖХ-методик
- Обеспечение прослеживаемости измерений в ВЭЖХ.
- Как на практике выглядит пригодное ВЭЖХ разделение. Критерии пригодности хроматографической системы.
- Квалификация протокола обработки данных. Различия в расчете параметров разделения (отношение сигнал/шум, эффективность, асимметрия, разрешение) по «стандартному» набору формул, формулам EP и формулам USP.
- Основы валидации ВЭЖХ методик. Валидационные характеристики.
- Специфичность. Протокол валидации специфичности.
- Робастность. Особенности валидации робастности. Протокол валидации робастности. Упущения при ва-лидации робастности как одна из основных причин невоспроизводимости ВЭЖХ методик. Как распознать неробастную методику.
- Подтверждение линейности. Определение пределов обнаружения/ определения. Способы уменьшения пределов обнаружения/определения.
- Валидация правильности. Рабочий диапазон методики. Отличие нижней границы рабочего диапазона от предела определения.
- Оформление методики согласно международным рекомендациям.
- Трансфер ВЭЖХ методик. Протокол трасфера. Основные проблемы при трансфере методик. Неробаст-ные ВЭЖХ измерения как основная причина затруднений при трансфере ВЭЖХ методик.

Практическая часть: разработка методики определения смеси фармацевтических соединений в твердой лекарственной форме
- Анализ химических структур целевых соединений, выявление их основных адсорбционных свойств. Вы-бор подходящих хроматографических режимов для разделения смеси целевых веществ. Выбор опти-мальных способов регулирования селективности разделения.
- Проведение пробных разделений на выбранных неподвижных фазах в выбранных условиях. Расчет факторов удерживания, селективностей и разрешения критических пар. Выбор решения с оптимальной селективностью.
- Оптимизация разделения. Выбор скорости потока, длины колонки, диаметра частиц адсорбента.
- Валидация специфичности разделения.
- Расчет и формулирование критериев пригодности хроматографической системы.

Обсуждение вопросов и практических задач участников

Лекции: 26, 27, 28 сентября
место сбора: ул. Ленина, 34а, старое здание научной библиотеки (красная метка на карте)

Начало каждый день в 10.00, собираемся возле входа в старое здание

Практика: 29 сентября
ул. Аркадия Иванова, 49 (6 корпус ТГУ), сбор в холле первого этажа (синяя метка на карте)