- Идентификация примесей
- Разработка ВЭЖХ-разделения

• Разработка разделения примесей в реальной субстанции
• Идентификация примесей методом ВЭЖХ-МС высокого разрешения
• Доказательство чистоты хроматографического пика (peak purity) на диодном-матричном и масс-детекторе

- Получение стандартного образца примеси
- Количественный анализ

• Выделение примеси (критической) методом полупрепаративной ВЭЖХ
• Подтверждение структуры примеси методом ЯМР-спектроскопии, ВЭЖХ-МС высокого разрешения
• Установление относительного коэффициента чувствительности примеси

- «Предвалидация» методики
- Аттестация первичного СО
- Документирование разработки

• «Предвалидация» методики
• Обоснование критериев пригодности хроматографической системы
• Обоснование валидационных критериев
• Аттестация первичного СО предприятия на основе выделенной примеси (для качественного анализа)

Требования к показателю «Посторонние примеси». Рекомендации ICH Q3. Требования ГФ XIII. Порог регистрации, идентификации и токсикологического исследования. Генотоксичные примеси

Установление “профиля примесей”:
- обзор литературных источников (англоязычная научная литература, EDQM и др.)
- “хроматографический скрининг”: установление наличия и количества примесей
- формулирование задачи на разработку ВЭЖХ-методики контроля примесей

Разработка ВЭЖХ-разделения основного вещества и примесей:
- выбор режима (RP, NP, HILIC, ионообменная хроматография, смешанные режимы)
- выбор начальных условий: стационарная фаза, длина колонки, размер зерна сорбента, подвижная фаза
- достижение требуемого разделения  

Обоснование критериев пригодности хроматографической системы:
- критерии «хорошего» разделения
- критерии пригодности хроматографической системы не учтенные ГФ XIII
- выбор и обоснование «критической пары», по которой будет проводиться оценка разделяющей способности хроматографической системы

Оптимизация условий анализа: симметрия пиков, время анализа, “запас прочности”, робастность, чувствительность

Подтверждение чистоты хроматографического пика (мультиволновое детектирование, смена хроматографической системы, масс-спектрометрическое детектирование)

Подходы к идентификации примесей: с использованием чистых веществ/стандартов, идентификация методом ВЭЖХ-МС. Подготовка “образцов с примесями”: “состаривание”, стрессирование

Разработка условий хроматографического разделения примесей и оснвоного вещества (для фармацевтической субстанции)

Достижение требуемых параметров пригодности хроматографической системы

Доказательство чистоты пика (peak purity):
- определение спектральной чистоты пика;
- применение альтернативной хроматографической системы

Газовая и жидкостная хромато-масс-спектрометрия. Ввод образца, источники ионизации (EI, ESI)

Масс-анализаторы (Q, QQQ, TOF, Q-TOF) и режимы сканирования ионов (full scan (MS mode), auto MS/MS, targeted MS/MS). Скорость сканирования, чувствительность, динамический диапазон, разрешение

Скрининговый анализ методом ГХ-МС, базы данных (NIST, Wiley, AMDIS и др.). Подтверждения структуры органических соединений методом ГХ-МС

Скрининговый и таргетный анализ методом ВЭЖХ-МС. Ограничения метода. Адаптация аналитических ВЭЖХ разделений для проведения масс-спектрометрического анализа

Применение ВЭЖХ-МС:
- подтверждение структуры органических соединений, примеры идентификации
- идентификация примесей в субстанциях и препаратах

Перенос аналитического ВЭЖХ-разделения на ВЭЖХ-МС систему

Идентификация примесей в субстанции

Подтверждение чистоты хроматографического пика основного вещества

Оформление протокола

Жидкостной квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения Agilent 6550 iFunnel Q-TOF

Только практика

Перенос условий аналитического ВЭЖХ-разделения на полупрепаративную колонку. Достижение необходимого разделения

Сбор целевой фракции. Высушивание, получение чистого образца примеси. Определение хроматографической чистоты полученного образца

Оформление протокола наработки

Количественное определение примесей методом ВЭЖХ: одноточечная градуировка

Когда примесей много: градуировка по основному веществу, относительные коэффициенты чувствительности
Критерии пригодности для количественного анализа: ПКО, прецизионность

«Предвалидация»: предварительная оценка ПКО, прецизионности, линейности, правильности, робастности
Обоснование критериев пригодности и валидационных критериев

Установление коэффициента чувствительности по выделенной примеси относительно основного вещества

«Предвалидация» методики: оценка линейности, прецизионности, правильности, ПКО

Обоснование критериев пригодности и валидационных критериев

ЯМР-спектроскопия на ядрах 1H. Химический сдвиг, мультиплетность, интегральная интенсивность. Спин-спиновое взаимодействие. Расшифровка простейших структур по 1H-спектрам

13С-спектроскопия. Химический сдвиг. Особенности углеродных спектров. Метод DEPT

Двумерные спектры. Гетеро-ядерная корреляция C-H, N-H (HMBC, HSQC), гомо-ядерная корреляция (COSY 1H-1H)

Растворители для ЯМР

Анализ выделенной примеси методом ЯМР: запись 1H- и 13C-спектров.

Обработка и интерпретация спектров, заключение по структуре молекулы
ЯМР-анализ образцов слушателей (1-2 шт.)

Подтверждение структуры выделенной примеси методом ВЭЖХ-МС высокого разрешения

ЯМР-спектрометр Bruker AVANCE 400 III HD

ISO Guide 30, стандартные образцы (RM) и сертифицированные (аттестованные) стандартные образцы (CRM)

СО для качественного и количественного анализа: показатели качества и назначение.

Первичные (primary) и вторичные (secondary) СО

Международные СО национальные (государственные) СО, отраслевые СО, СО предприятия

Фармакопейные СО. Требования ГФ XIV к стандартным образцам для анализа фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов

Что делать если нужные СО нигде не продаются?
Аттестация первичных и вторичных СО (для качественного и количественного анализа).

СО предприятия. Документация. Упаковка. Хранение.

Оформление комплекта документов на первичный СО предприятия (для качественного анализа) на основе выделенной примеси.